ایمنی درمانی با استفاده از آب غنی شده با اکسیژن
و اگزوزوم های حاصل از تومور باعث تقویت پاسخ ایمنی ضدتومور شده و خطر بدخیمی را در مدل سرطان سینه در موش کاهش می دهد
چکیده:
سرطان سینه یکی از رایج ترین انواع تومور است که موجب مرگ زنان می شود. تاکنون روش های درمانی متنوعی برای درمان تومورها به کار گرفته شده است. اما به بهبودی کامل منجر نشده و حتی به سلول های سالم بدن نیز آسیب رسانده است. علاوه بر این، تومورهای متاستاتیک، مانند تومور سینه، مقاومت بیشتری نسبت به درمان نشان می دهند و روش های درمانی رایج در درمان آنها خیلی موفق نبوده اند و این امر به صورت یک چالش باقی مانده است. بنابراین، روش های جدید باید در راستای غلبه بر این مشکل به کار گرفته شوند. مسئله اهمیت کمبود اکسیژن بافت در بقاء تومور، ما را بر آن داشت که تاثیرات ضد توموری آب غنی شده با اکسیژن را در کاهش کمبود اکسیژن طی تکثیر اگزوزوم های حاصل از تومور به تومور هدف را بررسی کنیم. هدف از به کارگیری آب غنی شده با اکسیژن و اگزوزوم های تومور، به ترتیب کاهش کمبود اکسیژن بافت و برقراری واکنش ایمنی تاثیرگذار علیه پادتن های تومور بود. بدین منظور، مدل سرطان سینه موش ها با استفاده از خط سلولی 4T1 در موش های balb/c القا شد و با آب غنی شده با اکسیژن از طریق مسیر درون توموری (IT) و یا مسیر درون صفاقی و اگزوزوم (TEX) به صورت توأم یا جداگانه درمان شد. اکسیژن دهی از طریق IT+IP مؤثرتر از اکسیژن دهی از طریق IP یا IT به تنهایی بود. تأثیر اکسیژن دهی از طریق دو مسیر همراه با TEX، بهترین نتیجه درمانی را در پی داشت. زمانی که اکسیژن دهی سیستمیک (IP) و محلی (IT) با هم به کار گرفته شدند، واکنش های ایمنی ضدتومور که توسط TEX اجرا می شود بهینه شدند. در صورتی که با بکارگیری TEX به تنهایی این نتیجه حاصل نشد. نتایج به کاهش قابل توجه اندازه تومور و بالاترین سطوح IFN-γ و IL-17 و پایین ترین سطوح IL-4، Fox-p3، HIF-lα، VEGF، MMP-2 و MMP-9 را در گروه درمان شده از طریق IT+IP+TEX نشان می دهد. از طرفی آب غنی شده با اکسیژن توانست اندازه تومور، کمبود اکسیژن بافت، تولید رگ جدید و متاستاز را در اطراف تومور کاهش دهد و از طرفی دیگر واکنش های ایمنی مؤثر علیه تومور را به صورت سیستماتیک افزایش دهد. این روش درمانی به عنوان راهبردی جدید برای تولید واکسن هایی با رویکرد شخصی پیشنهاد می شود.
هیپوکسی یکی از ویژگی های مهم تومورهای جامد است. مکانیسم های زیادی به عنوان عوامل دخیل در ایجاد شرایط های منجر به هیپوکسی در هسته های تومور مطرح شده اند. اینها شامل ریزش و یا انتقال محدود اکسیژن می باشد. سلول های تومور با هیپوکسی سازگار شده، در شرایط های سخت مقاومت کرده و حالت تهاجمی تر و متاستازتری به خود می گیرند. سلول های نرمال معمولا در شرایط های هیپوکسی می میرند اما سلول های تومور به میکرومحیطهای هیپوکسیک سازگار شده و زنده می مانند که به دلیل تغییرات پروتئومیک و ژنومیک بواسطه هیپوکسی در درون آنها می باشد. به علاوه، فشار فرآیند انتخاب در زمان مواجهه با هیپوکسی نیز منجر به بقای زیرجمعیت های خطرناک تر سلول های تومور شده که ژن های MMP-2، MMP-9 و VECF را بیان می کنند. شرایط های هیپوکسیک در میکرومحیط های تومور منجر به افزایش آنژیوژنز و متعاقبا مقاومت در برابر درمان با تعدادی از عوامل ضدسرطان می گردد. انواع مختلفی از شیوه های درمانی آنتی آنژیوژنیک که برای درمان تومورها به کار گرفته شده اند، هنوز موفقیت چندانی را حاصل نکرده اند و بر اساس پیش بینی مدل های ریاضیاتی، درمان کامل بر اساس ممانعت از آنژیوژنز، امکان پذیر نخواهد بود. بر این اساس، نرمال سازی عروق به جای درمان آنتی آنژیوژنز پیشنهاد شده است. این شیوه درمانی به ترمیم ساختار بافت و رساندن سطح نرمال اکسیژن به بافت های آسیب دیده کمک می کند.
مقاومت سلول تومور در اثر شرایط های هیپوکسیک، مانع اصلی پیش روی درمان مؤثّر سرطان می باشد. روش های متعددی به منظور تسهیل ایمونوتراپی برای سرطان مورد مطالعه قرار گرفته اند. اما علی رغم بیش از 40 سال تلاش، هیچ یک از این تلاش ها تاکنون همراه با موفقیت نبوده اند. با درنظرگیری نقش مهم نبود اکسیژن در گسترش، سازگاری و متاستاز تومور، پیشنهاد شده است که اکسیژناسیون می تواند با نابودکردن سلول های سرطانی سلامتی را برگرداند. طرفداران اکسیژن درمانی مدعیند که سطوح پایین اکسیژن، سلول های تومور را قادر می سازد تا سازگاری پیدا کرده و زنده بمانند. به این ترتیب، اکسیژناسیون سلول های تومور باعث مختل شدن تغییرات پروتئومیک و ژنومیک آنها شده و در نتیجه باعث نابودی آنها می گردد. همچنین، شرایط هیپوکسیک درون تومورها باعث ممانعت از بروز پاسخ های ایمنی ضدتومور می گردد.
روش های ایمونوتراپی که متمرکز بر آنتی ژن های تومور هستند برای رسیدن به خود تومورها مورد نیاز می باشند، اثرات جانبی کمتری دارند و اثربخشی بیشتری نسبت به روش های غیراختصاصی از قبیل شیمی درمانی یا پرتودرمانی دارند. در این راستا، روش های مختلفی ارائه شده اند که یکی از این روش ها، استفاده از اگزوزوم های حاصل از تومور می باشد که در واقع ریزکیسه های حاوی آنتی ژن های تومور هستند که می توانند توسط فاگوسیت ها جذب شوند. این اگزوزوم ها قادر به بر هم کنش با سلول های T بوده و بر رو وضعیت فعال سازی این سلول ها تأثیر می گذارند.
سرطان سینه شایع ترین نوع سرطان بوده و عامل اصلی مرگ و میر در زنان در سرتاسر جهان می باشد. بر این اساس و با هدف تنظیم میکرومحیط تومور و انگیزش پاسخ های ایمنی مختص آنتی ژن تومور، درمطالعه حاضر، آب غنی شده با اکسیژن و اگزوزوم های حاصل از تومور در یک مدل سرطان سینه در موش مورد استفاده قرار گرفت.
1-2- اظهارنامه اخلاقی
مطالعه حاضر پس از اخذ کد اخلاقی از کمیته اخلاق معاونت دانشگاه علوم پزشکی البرز با شماره ارجاع IR.ABZUMS.ERC.1397.154. آغاز گردید. افراد دخیل در پروژه حاضر تمام تلاش خود را برای رعایت استانداردهای اخلاقی تحقیق پزشکی در همه مراحل این مطالعه به کار بستند.
2-2- حیوانات
موش های ماده BAL/c با سن 10-8 هفته از مؤسسه رویان (کرج، ایران) خریداری شدند. به موش ها غذا و آب به طور آزادانه داده شد و به مدت یک هفته قبل از شروع آزمایش در شرایط استاندارد نگهداری شدند. همه آزمایشات بر اساس دستورالعمل مراقبت و استفاده از حیوانات در دانشگاه علوم پزشکی البرز انجام شد.
3-2- خط سلولی و آماده سازی مدل سرطان سینه در موش
خط سلولی سرطان سینه موش به نام 4T1 از انستیتو پاستور، بانک سلول ایران (NCBI، تهران، ایران) تهیه گردید. سلول ها در محیط کشت RPMI 1640 با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS)، 1 درصد گلوتامین، IU/ml 100 استرپتومایسین و IU/ml 100 پنی سیلین دردمای 37 درجه سانتیگراد در شرایط جوی مرطوب کشت داده شدند.
یک سوسپانسیون 15/0 میلی لیتری حاوی 105 × 6 سلول 4T1 به صورت زیرجلدی در ناحیه پهلوی پشتی تزریق شد. قفس ها کدگذاری شدند، توده های نئوپلاستیک با استفاده از یک کولیس اندازه گیری شدند، اندازه تومور به صورت یک روز در میان در همه موش ها سنجیده شد و منحنی های رشد تهیه شدند. حجم تومور با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید:
حجم تومور = (طول × عرض2) ÷ 2
4-2- آماده سازی و جداسازی اگزوزوم
اگزوزوم از سلول های 4T1 کشت داده شده در محیط کشت RPM1 1640 حاوی 10 درصد FBS بدون اگزوزوم که با سانتریفیوژ FBS به مدت 15 ساعت با سرعت g 120000 در دمای 4 درجه سانتیگراد حاصل شد، انجام گردید. اگزوزوم با استفاده از اولتراسانتریفیوژ گرادیان از محیط کشت جداسازی شد. به طور خلاصه، محیط کشت از سلول های 4T1 کشت داده شده به مدت 72 ساعت و سانتریفیوژ شده با سرعت g 300 به مدت 10 دقیقه برای حذف سلول های متصل نشده و ته نشین شده، جمع آوری شد. سپس سوپرناتانت از اولتراسانتریفیوژ گرادیان با سرعت g 2000 به مدت 10 دقیقه، g 30000 به مدت 10 دقیقه و g 110000 به مدت 70 دقیقه عبور داده شد تا به ترتیب هرگونه جسم آپوپتیک، ریزکیسه و پروتئین های آلوده کننده حذف شوند.
5-2- شناسایی اگزوزوم از طریق DLS، SEM، TEM و آنالیز وسترن بلات
پلت های اگزوزوم تا میزان 200 میکرولیتر رقیق سازی شدند. سپس، اندازه، همگنی و غلظت اگزوزوم جداسازی شده با استفاده از یک زتاسایزر Nano ZS90 و کیت سنجش پروتئین BCA مورد بررسی قرار گرفت. همچنین، خلوص و مورفولوژی اگزوزوم به دست آمده با استفاده ازمیکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) بررسی شد.
مارکرهای سطحی اگزوزوم هم با استفاده از وسترن بلات شناسایی شدند. پس از دناتوره شدن، جداسازی پروتئین با استفاده از روش الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید (SDS-PAGE) مورد بررسی قرار گرفت. پس از انتقال نمونه بر روی غشاهای پلی وینیلیدن دی فلوراید (PVDF)، بیان پروتئین های مارکر مختص اگزوزوم با استفاده از آنتی بادی های مقابل ژن 101 حساسیت به تومور (TSG101) یعنی CD63، CD81 و CD9 تحلیل شد. تجزیه و تحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار ImageJ انجام شد.
6-2- تیمار با/بدون آب غنی شده با اکسیژن با/بدون یک اگزوزوم
درمان در روز دهم پس از استقرار تومور زمانی که تومور قابل لمس بود (حدودا 100-75 میلی متر مکعب)، آغاز شدند. به منظور ارزیابی اثر درمانی آب غنی شده با اکسیژن و یا اگزوزوم، شش گروه (به تعداد 8-6 نفر) با مشخصات ذکر شده در جدول 1 مد نظر قرار داده شدند و بر اساس دستورالعمل نشان داده شده در شکل 1 درمان شدند. درمان به مدت 15 روز ادامه پیدا کرد و در روز هجدهم، سه روز پس از آخرین تزریق، بافت های طحال و تومور موش ها جداسازی شدند. حجم تومور به صورت یک روز در میان با استفاده از یک کولیس به مدت 15 روز اندازه گیری شد. اندازه گیری توسط یک نفر به تعداد دو بار انجام شد. آب غنی شده با اکسیژن از طریق مسیر داخل صفاقی (IP) و یا داخل توموری (IT) وارد شد و یک اگزوزوم حاصل از تومور (TEX) از طریق مسیر زیرجلدی (SC) وارد گردید. آب غنی شده با اکسیژن حاوی ppm 85 اکسیژن به صورت روزانه تزریق شد و TEX (100 میکروگرم) هر سه روز به درون ناحیه اطراف تومور تزریق شد.
7-2- آماده سازی بافت برای رنگ آمیزی ایمونوهیستوکمیکال
پس از تکمیل دستورالعمل درمان، حیوان ها با استفاده از مخلوط کتامین و زایلازین بیهوش شده و طحال انها خارج گردید. طحال های جداشده در فرمالین 10 درصد خنثی، تثبیت شدند. سپس، نمونه ها در پارافین قرار داده شده و قسمت هایی با ضخامت 5 میکروکتر بر روی یک روتاری میکروتوم آماده شدند. این قسمت ها بر روی لام های پوشانده شده با پلی لایزین قرار داده شده و برای رنگ آمیزی ایمونوهیستوکمیکال مورد استفاده قرار گرفتند. قسمت های بافت با Triton X-100 3/0 درصد و سرم بز 10 درصد در PBS (pH 3/7) به مدت 30 دقیقه بلاک شدند. سپس، آنتی بادی های اولیه اضافه شدند و به مدت یک شب در دمای اتاق به همراه interferon-γ، interleukin-17، IL-4 و Forkhead box P3 مورد انکوباسیون قرار گرفتند. پس از شستشو با PBS 01/0 مولار، قسمت های بافتی با FITC-conjugated donkey anti-rabit IgG رقیق شده در PBS 01/0 مولار (1:200) به عنوان آنتی بادی ثانویه به مدت 2 ساعت در دمای اتاق مورد انکوباسیون قرار گرفتند. سپس، پس از شستن با PBS 01/0 مولار، این قسمت ها به لام های شیشه ای چسبانده شده و با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شدند. برای رنگ آمیزی هسته ها در هر قسمت، از DAPI استفاده شد. ارزیابی کمّی و آنالیز قسمت های بافتی رنگ آمیزی شده با روش ایمونوهیستوکمیکال، پس از گرفتن تصاویر دیجیتال با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس Zeiss Axioplan 2 انجام شد. از نرم افزار ImageJ به منظور تجزیه و تحلیل تصاویر دیجیتال با یک مشاهده گر بلایند شده به منشأ نمونه استفاده شد.
8-2- استخراج RNA و real-time PCR
استخراج RNA کل از تومور منجمد با استفاده هاز TRIzolTM Reagent بر اساس یک دستورالعمل استاندارد و روش ارائه شده در یکی از مقالات گذشته انجام شد. به منظور بررسی کیفیت و کمیت غلظت های RNA، از NanoDrop 2000c استفاده گردید. بیان mRNA برای هیپوزانتین فسفریبوسیل ترانسفراز (HPRT)، HIF-1α، گیرنده A فاکتور رشد اندوتلیال واسکولار و MMP-2 و MMP-9 با استفاده از ترموسایکلر ABI StepOnePlus و SYBR® Green PCR Master Mix بر اساس دستورالعمل های سازنده ها مورد بررسی قرار گرفتند. هر واکنش حاوی 10 میکرولیتر Master Mix، 1 میکرولیتر پرایمر برای HPRT (nM 100(T ، HIF-1α، گیرنده A فاکتور رشد اندوتلیال واسکولار و MMP-2 و MMP-9 و 1 میکرولیتر (ng 200) cDNA تمپلیت سنتز شده با کیت های cDNA و 8 میکرولیتر آب دی اتیل پیروکربنات (DEPC) بود. توالی ها برای پرایمرها شامل ... (به ستون دوم صفحه 3 در نسخه اصلی مقاله مراجعه شود) بودند. کارایی و اختصاصیت این پرایمرها، درستی و صحت real-time PCR و آنالیز منحنی ذوب به شیوه سابق مورد بررسی قرار گرفتند. شرایط های ترموسایکلر شامل یک مرحله اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 ثانیه، 63-56 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه (دمای انیلینگ هر پرایمر) و 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه بود. ژن HPRT به عنوان کنترل درونی انتخاب شد که بیان mRNA در ژن هدف با توجه به آن، نرمال سازی شد. سطح حاصل شده برای بیان ژن به صورت 2-ΔΔCt نشان داده شد که در آن، ΔCt تفاوت بین مقادیر Ct در ژن هدف و ژن مرجع بود.
9-2- تجزیه و تحلیل آماری
عملیات آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism به منظور آنالیز داده ها با استفاده از ANOVA یک طرفه به منظور مقایسه بین گروه ها و سپس با استفاده از آزمون تعقیبی توکی انجام شد. نتایج مربوط به اندازه تومور با استفاده از ANOVA دو طرفه و آزمون تعقیبی بونفرونی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تفاوت ها زمانی که مقدار p کمتر از 05/0 بود، از لحاظ آماری معنی دار در نظر گرفته شد.
1-3- ارزیابی اگزوزوم ها
اگزوزم های حاصل از سوپرناتانت های کشت سلولی 4T1 با استفاده ه ار زوش پراکندگی نور دینامیکی (DLS)، TEM، SEM و وسترن بلاتینگ مورد ارزیابی قرار گرفتند. همانطور که در شکل a2 نشان داده شده و همچنین بر اساس DLS، اگزوزوم های جداسازی شده اندازه یکنواختی داشتند و حداکثر اندازه آنها SD nm 5/8 ± 96 بود که در محدوده مناسب اندازه اگزوزوم ها (nm 30-120) قرار دارد. به طور مداوم، نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی اگزوزوم ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی، یکنواختی این جمعیت در محدوده nm 30-120، مورفولوژی کروی آنها و یک غشای فسفولیپید دولایه را نشان می دهد (شکل b2 و c2). نتایج حاصل از آنالیز وسترن بلات هم نشان داد که اگزوزوم های ترشح شده هاز سلول های تومور 4T1، مارکرهای CD81، CD9، CD63 و TSG101 را بیان می کنند (شکل d2) که در کنار آنها، از بتا اکتین به عنوان کنترل داخلی استفاده شد.
2-3- اندازه و رشد تومور
همانطور که در شکل a3 نشان داده شده، اندازه تومور در گروه کنترل به طور فزاینده ای افزایش یافته است، اما یک روند کاهشی در گروه های تحت درمان مشاهده گردید. در روز سیزدهم پس از آغاز درمان، یک تفاوت معنی دار بین گروه شاهد و گروه های IT (001/0>p)، IT+IP (05/0>p)، IT+IP+TEX (05/0>p) و TEX (05/0>p) وجود داشت. به علاوه، تفاوت معنی داری بین گروه شاهد و گروه های درمان شده با IT+TEX (0001/0>p)، IT+IP (00001/0>p)، IT+IP+TEX (0001/0>p) یا TEX (0001/0>p) در روز پانزدهم پس از درمان مشاهده شد. اندازه تومور تفاوت معنی داری بین گروه های مختلف تحت درمان نشان نداد.
3-3- هیپوکسی، آنژیوژنز و پتانسیل متاستاتیک تومور
تفاوت در بیان mRNA در ژن های HIF-1α، VEGF-A، MMP-2 و MMP-9 در هسته های تومور در شکل های b3 تا e3 نشان داده شده است. همانطور که در شکل b3 دیده می شود، بیان ژن HIF-α در گروه شاهد به طور معنی داری بالاتر از گروه های تحت درمان بود(001/0>p). با این حال، بیان این ژن در گروه TEX به طور معنی داری بالاتر از گروه های IP+IT (01/0>p)، IP+IT+TEX (001/0>p)، IT+TEX (001/0>p) و IT (05/0>p) بود. به علاوه، بیان این ژن در گروه IT به طور معنی داری بالاتر از گروه های IP+IT+TEX، IT+TEX و IP+IT بود (001/0>p). همچنین قابل ذکر است که بیان این ژن در گروه IT+TEX به طور معنی داری بالاتر از گروه های IP+IT+TEX و IP+IT بود (001/0>p). بر این اساس، بیان ژن HIF-α را می توان به این شکل خلاصه نمود:
IP+IT+TEX < IP+IT < IT+TEX < IT < TEX < CTL
بررسی بیان ژن VEGF-A (شکل c3) نشان داد که بیان این ژن در گروه شاهد به طور معنی داری بالاتر از گروه های تحت درمان بود (001/0>p). با این حال، تفاوت های معنی داری بین گروه های تحت درمان با آب غنی شده با اکسیژن و با/بدون اگزوزوم مشاهده شد. بیان این ژن در گروه TEX به طور معنی داری بالاتر از IT (01/0>p)، IT+TEX (001/0>p)، IT+IP (001/0>p) و IP+IT+TEX (001/0>p) بود. همچنین، بیان این ژن در گروه IT به طور معنی داری بالاتر از گروه های IT+TEX، IP+IT و IP+IT+TEX بود (001/0>p). همانطور که در شکل c3 نشان داده شده، بیان این ژن در گروه IT+TEX به طور معنی داری بالاتر از IP+IT (01/0>p) و IP+IT+TEX (001/0>p) بود. گروه های IP+IT و IP+IT+TEX هم تفاوت معنی داری از لحاط بیان این ژن داشتند (01/0>p). بیان ژن VEGF را می توان به شکل زیر خلاصه نمود:
IP+IT+TEX < IP+IT < IT+TEX < IT < TEX < CTL
به منظور ارزیابی پتانسیل های متاستاتیک یک تومور، بیان ژن MMP-2 مورد ارزیابی قرار گرفت. همانطور که در شکل d3 نشان داده شده، بیان این ژن در گروه شاهد به طور معنی داری بالاتر از گروه های تحت درمان است (001/0>p). با این حال، بین گروه های تحت درمان، بیان این ژن در گروه TEX به طور معنی داری بالاتر از گروه های IT (05/0>p)، IT+TEX (001/0>p)، IP+IT (001/0>p) و IP+IT+TEX (001/0>p) بود. همچنین، سطح بیان این ژن در گروه IT به طور معنی داری بالاتر از IP+IT، IT+TEX و IP+IT+TEX داشت (001/0>p). هیچ تفاوت معنی داری در بیان این ژن بین گروه های IP+IT و IT+TEX مشاهده نشد. در نهایت، سطح بیان این ژن در گروه IP+IT+TEX به طور معنی داری پایین تر از گروه های IP+IT و IT+TEX بود (001/0>p). سطح بیان ژن MMP-2 را می توان به شکل زیر خلاصه نمود:
IP+IT+TEX < IP+IT ≈ IT+TEX < TEX < IT < CTL
مثل MMP-2، بیان ژن MMP-9 (شکل e3) در گروه شاهد به ور معنی داری بالاتر از گروه های تحت درمان بود (001/0>p). با این حال، در بین گروه های تحت درمان، بیان این ژن در گروه TEX به طور معنی داری بالاتر از گروه های دیگر بود (001/0>p). همچنین، سطح بیان این ژن در گروه IT به طور معنی داری بالاتر از IT+TEX (05/0>p)، IP+IT (001/0>p) و IP+IT+TEX (001/0>p) بود. در نهایت، سطح بیان این ژن در گروه IT+TEX به طور معنی داری بالاتر از گروه های IP+IT و IP+IT+TEX بود (01/0>p). هیچ تفاوت معنی داری در بیان این ژن بین گروه های IP+IT و IT+TEX مشاهده نشد. سطح بیان ژن MMP-9 را می توان به شکل زیر خلاصه نمود:
IP+IT+TEX ≈ IP+IT < IT+TEX < IT < TEX < CTL
4-3- پروفایل پاسخ سلول T
طحال به عنوان یک اندام لنفاوی در نظر گرفته می شود که به صورت محلی (در پاسخ به آنتی ژن های خونی) و عمومی عمل می کند. نقش و اهمیت طحال در تنظیم پاسخ های سیستم ایمنی آن قدر زیاد است که آن را تحت عنوان فشارسنج پاسخ های ایمنی سیستمیک می شناسند. سنجش پاسخ های ایمنی در طحال، توازن و میزان پاسخ های ایمنی را در سرتاسر بدن نشان می دهد و مشخص می کند که تا چه حدی این پاسخ ها ممکن است در کنترل رشد تومور دخیل باشند.
بر این اساس، سطوج IFN-γ، IL-4، IL-17 و FoxP3 به عنوان نماینده های Th1، Th2، Th17 و سلولهای T تنظیم کننده (Treg) در طحال مورد بررسی قرار گرفتند. همانطور که در شکل a4 و b4 نشان داده شده، سطوح بیان IFN-γ هم به طور معنی داری بین گروه های تحت درمان تفاوت داشت. نقدار بیان IFN-γ در گروه های تحت درمان را می توان به شکل زیر خلاصه نمود:
CTL < TEX < IT < IT+TEX ≈ IP+IT <IP+IT+TEX
به همین شکل، مقدار IL-17 که مثل IFN-γ یک سایتوکین التهابی می باشد، به طور معنی داری در طحال گروه شاهد در مقایسه با گروه های تحت درمان کمتر بود (001/0>p). همانطور که در شکل های b4 و c4 نشان داده شده، هر دوی پاسخ های Th1 و Th17 که شاخص های پاسخ های التهابی هستند، افزایش معنی داری در گروه های تحت درمان در مقایسه با گروه شاهد داشتند. مشابه با روند مشاهده شده در مورد IFN-γ، سطوح IL-17 در گروه های تحت درمامن را می توان به شکل زیر نشان داد:
CTL < TEX < IT < IT+TEX ≈ IP+IT <IP+IT+TEX
در مقابل، IL-4 افزایش معنی داری در طحال گروه شاهد در مقایسه با گروه های تحت درمان داشت (001/0>p؛ شکل های a5 و b5). همچنین، سطح IL-4 تفاوت معنی داری بین گروه های تحت درمان نشان داد. بر این اساس، ترتیب IL-4 که در ادامه آمده، با ترتیب نشان داده شده برای IFN-γ و IL-17 تفاوت داشت:
IP+IT+TEX < IP+IT ≈ IT+TEX < IT < TEX < CTL
سطوح FoxP3 هم به عنوان شاخص Treg در طحال مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل های c5 و d5 نشان داده شده، سطح Treg در طحال گروه شاهد به طور معنی داری بالاتر از گروه های تحت درمان بود (001/0>p). نکته هقابل توجه این بود که سطح Treg هم در بین گروه های تحت درمان تفاوت داشت. مطابق انتظار، ترتیب سطح FoxP3 روند متفاوتی با ترتیب IFN-γ و IL-17 داشت و با IL-4 مشابه بود:
IP+IT+TEX < IP+IT ≈ IT+TEX < IT < TEX < CTL
هیپوکسی تومور یک مشکل جدی بوده و اثرات مخربی بر روی درمان تومور دارد زیرا باعث کاهش حساسیت شیمی درمانی و پرتودرمانی می شود. با توجه به نقش مهم محرومیت از اکسیژن در ایجاد تومور و سازگاری و متاستاز آن، پیشنهاد شده است که اکسیژن دهی می تواند با تخریب سلول های سرطانی، سلامتی را برگرداند. طرفداران اکسیژن درمانی ادعا می کنند که سطوح پایین اکسیژن امکان سازگار شدن و رشد را به سلول های تومور می دهد. بنابراین، اکسیژن دهی به سلول های تومور باعث مختل شدن تغییرات پروتئومیک و ژنومیک در آنها شده و می تواند این سلول ها را نابود کند. ایده اولیه اکسیژن درمانی برای درمان سرطان با استفاده از ازون یا پرکسید هیدروژن که تجزیه شده و اکسیژن آزاد می کند، به دهه ها قبل برمی گردد. مطالعات بعدی هم اثرات سودمند اکسیژن درمانی در درمان برخی از انواع سرطان را نشان داده اند. برای مثال، این گونه بیان شده که اثر شیمی درمانی بلافاصله پس از اکسیژن درمانی هایپرباریک، افزایش معنی داری داشته است. تحقیقات دیگر اذعان داشته اند که اکسیژن تأثیر شدیدی بر روی پاسخ های ایمنی تنظیمی دارد که در هسته های تومور، غالب هستند. در واقع، هیپوکسی باعث افزایش میزان استفاده از Treg در محل تومور می شود، فعالیت آنها را در هسته های تومور بالا می برد و پاسخ سلول T افکتور آنتی تومور را سرکوب می کند. بر همین اساس، گزارشات گذشته، آنژیوژنز بواسطه اکسیژن، نرمال سازی عروق با اکسیژن دهی مناسب و اثرات آنتی متاستاتیک اکسیژن هایپرباریک را به جای هیپوکسی پیشنهاد داده اند. مهمتر اینکه یکی از مطالعات گذشته نشان دادند که نوشیدن آب غنی شده با اکسیژن حاوی ppm 30-120 اکسیژن هیچ اثر مضری بر روی شمار کلی خون و یا بر روی آنزیم های کبدی نداشته و نسبت Th1/Th2 را افزایش داده است. مطالعات بالینی و تجربی نشان دادند که آب غنی شده با اکسیژن دارای مزایای فیزیولوژیکی و ایمونولوژیکی می باشد و اکسیژن بیشتری را در اختیار بدن قرار می دهد. در شرایط های پاتولوژیکی، تعدادی از گزارشات بالینی به اثرات سودمند آب غنی شده با اکسیژن برای بیماران مبتلا به انواع گسترده ای از بیماری ها از قبیل سرطان سر و گردن اشاره داشته اند. پیشنهاد شده که ازون یا پرکسید هیدروژن باعث افزایش اکسیژن و کاهش هیپوکسی می گردد. هم ازون و هم پرکسید هیدروژن اثرات ضدتوموری نشان داده اند. نشان داده شده که استفاده از آب ازونه باعث افزایش انتشار خون درون توموری گردیده و باعث بهبود شرایط های هیپوکسیک در هسته های تومور می شود که منجر به افزایش بازده درمانی می گردد. پرکسید هیدروژن همچنین تا حدی باعث افزایش آپوپتوز شده و توقف چرخه سلولی چندفازه و تکثیر در سلول های 4T1 می شود. در یکی از مطالعات گذشته که در آن از آب نانوحباب دار غنی شده با اکسیژن در یک مدل مشابه سرطان سینه در موش استفاده شد، حجم تومور تا 25 درصد کاهش یافت. اثرات سودمند اکسیژن دهی به دخالت اکسیژن در فعال سازی ژن سرکوب کننده تومور p53 و حذف کامل لاکتات که به عنوان یک انکومتابولیت مهم در برنامه نویسی متابولیک تومورها شناخته می شود، نسبت داده شده است. لاکتات به اسیدی شدن میکرومحیط تومور کمک می کند که در عوض شرایط را برای فرآیندهایی از قبیل آنژیوژنز و متاستاز فراهم می کند. مهمتر اینکه لاکتات همچنین سبب سرکوب ایمنی می شود که نشانه ای از یک پروگنوز بالینی بدتر می باشد. این مطالعه همچنین اثر بازدارندگی استفاده از آب غنی شده با اکسیژن به صورت درون توموری و درون صفاقی را بر روی آنژیوژنز با توجه به VEGF-A و همچنین بر روی پتانسیل های متاستاتیک با توجه به سطوح MMP-2 و MMP-9 نشان داد. بر این اساس، اثرات سودمند اکسیژن دهی صرفا محدود اکسیژن هایپرباریک یا نوشیدنی نمی باشد. جای تعجب ندارد که اکسیژن همچنین به عنوان یک داروی کمکی یا ویتامین O نیز مطرح شده است. با درنظرگیری تومور به عنوان یک بیماری سیستمیک با بروز به شکل محلی، اکسیژن دهی از طریق مسیرهای درون توموری و درون صفاقی به صورت توأم، کارایی بالاتری نسبت به اکسیژن دهی از طریق هر یک از این مسیرها به طور جداگانه داشت. مسیر درون صفاقی به عنوان یک مسیر سیستمیک در نظر گرفته می شود و به نظر می رسد که اکسیژن دهی سیستمیک با تومورهای سیستمیک مبارزه می کند که برای پاسخ های ایمنی امری مطلوب می باشد. همچنین، اکسیژن دهی از طریق یک مسیر درون توموری نیز با شرایط های هیپوکسیک و تومورها مبارزه کرده و از پاسخ های ایمنی محلی، حمایت می کند. با این حال، یک نتیجه درمانی مطلوب با استفاده هاز اکسیژن و اگزوزوم های حاصل از تومور در مطالعه حاضر حاصل گردید که در ادامه مورد بحث قرار می گیرد.
اکسیژن دهی به تنهایی برای مبارزه با تومورها کافی نیست. در واقع، اکسیژن دهی تنها یک شرایط سرکوب کننده ایمنی را به یک میکرومحیط مطلوب برای پاسخ های ایمنی تبدیل کرده و حفاظت از تومور از طریق آدنوزین برون سلولی را کاهش می دهد. بر این اساس، پیشنهاد شده که تحریک سلول های ایمنی ضدتومور به منظور ریشه کن کردن تومور لازم است. برای ایجاد یک روش ایمنی درمانی دولبه که میکرومحیط تومور را تنظیم کرده و یک پاسخ ایمنی ضدتومور را تحریک کرده و تقویت کند، اگزوزوم ها به عنوان منبعی از آنتی ژن های تومور به همراه آب غنی شده با اکسیژن در مطالعه حاضر به کار گرفته شدند. استفاده از اگزوزوم های حاصل از تومور برای ایمنی درمانی سرطان قبلا هم پیشنهاد شده و مورد بررسی قرار گرفته بود. در مورد مدل سرطان سینه در موش 4T1، ایمنی درمانی با استفاده از اگزوزوم ها در یکی از مطالعات گذشته توانسته بود تنها تا حدی باعث کاهش سرعت رشد تومور به میزان تقریبا نصف شود، اما استفاده از اگزوزوم ها به همراه آب غنی شده با اکسیژن در مطالعه حاضر باعث کاهش اندازه تومور و رسیدن آن تا یک هشتم اندازه اولیه گردید. یک مطالعه آزمایشگاهی دیگر نشان داد که اگزوزوم های حاصل از سلول 4T1 به رسیده شدن سلول های دندریتیک کمک می کند. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که کارایی اکسیژن دهی به همراه اگزوزوم ها باعث حصول نتیجه درمانی بهتری گردید. بررسی های مولکولی پیشنهاد می کنند که اکسیژن دهی از طریق دو مسیر، یعنی درون توموری و درون صفاقی، منجر به حصول نتیجه درمانی بهتری در زمان استفاده توأم از اگزوزم ها شده است. بنابراین، بر اساس نتایج حاصل از مطالعه حاضر می توان بیان کرد که پاسخ های ایمنی ضدتومور که توسط اگزوزم ها هدایت می شوند قدرت و بهینگی بالاتری به صورت استفاده توأم با اکسیژن دهی به صورت سیستمیک (IP) و محلی (IT) در مقایسه با صرفا استفاده از اگزوزوم ها به تنهایی دارد. این نتیجه گیری همچنین با استناد به کارایی یکسان بین دو گروه تحت درمان با IP+IT و IT+TEX نیز تأیید می شود. اهمیت اکسیژن دهی با توجه به کمترین کارایی درمانی در گروه TEX در مقایسه با دیگر گروه های تحت درمان، کاملا آشکار شد.
هرچند ما فنوتیپ ماکروفاژ را در مطالعه حاضر بررسی نکردیم، اما سطوح VEGF-A، MMP-2 و MMP-9 نشان دهنده تغییرات میکرومحیط تومور هستند چرا که آنها توسط مارکروفاژهای M2 تولید می شوند. در مورد اهمیت تنظیم میکرومحیط تومور با آب غنی شده با اکسیژن ، قابل ذکر است که اگزوزوم های حاصل از ماکروفاژهای درون تومور منجر به رشد و توسعه تومور شدند. به علاوه، هیپوکسی باعث ارتقای ماکروفاژها به سمت فنوتیپ M2 می شود که برای رشد تومور، مطلوب می باشد. در نتیجه، اگزوزوم های حاصل از سلول 4T1 می توانند تا حدی ماکروفاژهای را تحریک کنند تا سایتوکین های پیش التهابی را تولید کنند که این استدلال با مطالعه دیگری در گذشته مطابقت دارد که در آن مطالعه، قطبی شدن ماکروفاژ به سوی وضعیت فعال سازی M1 نشان داده شد. با توجّه به ایمونومتابولیسم تومور، قطبی شدن ماکروفاژها به فنوتیپ M1 باعث شدت یافتن نرمال سازی کیسه تومور، اکسیژن دهی مجدد تومور و بازدارندگی از متاستاز در اثر رقابت متابولیک بین سلول های ایمنی و تومور در اثر اکسیژن دهی می شود. در همین راستا، گزارش هایی بوده اند که به اهمیت گرادیان اکسیژن درون توموری و دسترسی به اکسیژن به عنوان یک تنظیم کننده اصلی انتقال فنوتیپ از M1 به M2 و بالعکس اشاره داشته اند. با این حال، استفاده از اگزوزوم ها به همراه آب غنی شده با اکسیژن در مطالعه حاضر هم برای تقویت پاسخ ایمنی ضدتومور حائز اهمیت بود، چرا که در یکی از مطالعات گذشته بیان شد که اکسیژن دهی به تنهایی نتوانست فنوتیپ ماکروفاژ حاصل شده در شرایط هیپوکسیک تومور را تغییر دهد.
مطالعه حاضر، اکسیژن دهی سیستمیک و محلی را به همراه ایمنی درمانی با استفاده از اگزوزوم های حاصل از تومور به عنوان یک روش جدید ایمنی درمانی ترکیبی پیشنهاد نمود. این روش باعث تحریک یک پاسخ ایمنی ضدتومور با استفاده از اکسیژن دهی سیستمیک به همراه اگزوزوم های حاصل از تومور می شود و در ضمن، اکسیژن دهی محلی نیز میکرومحیط تومور را تنظیم کرده، مکانیسم ایمنی حفاظت کننده از تومور را تضعیف نموده و سلول های ایمنی ضدتومور را تقویت کرده و امکان ورود آنها به هسته های تومور را فراهم می کند.